| 適用范圍 | 試劑 |
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| 使用方法 | 1. 第 0 天，滅活血漿制備：采集的血樣需要在 8 小時內分離；將抗凝血液樣本 2000rpm 離心 10min，取上層血漿移到新的離心管，56℃條件下滅活 30min，冷卻至室溫，2500rpm 離心 10min，用移液管將上清液采集至新的離心管，加入葡萄糖酸鈣，使其終濃度為 8%，保存在冰箱中，直到使用前取出。 2. 制備 PBMC，應用不同淋巴細胞分離液可根據相關說明書操作。 3. 培養基的配制：免疫細胞無血清培養基加入重組人 IL-2 使終濃度為 200IU/ml； 4. 將試劑 A1 置于 37℃快速融化復蘇，復蘇時間不宜過長，然后用生理鹽水清洗一次，1400rpm 離心 5 分鐘之后再用 10ml 免疫細胞無血清培養基重懸，加入到 T75 培養瓶中； 5. 將制備好的 PBMC 取 2×107cells 加入 20ml 免疫細胞無血清培養基，再加入 1.5ml 滅活的自體血漿，加入到含有試劑 A1 的 T75 培養瓶中混合，置于 37℃、5%CO2的培養箱培養。 6. 第 3 天將培養瓶中的細胞液轉移到 50ml 離心管中，1400rpm 離心 5min； 7. 吸棄上清液，收集細胞，添加 30ml 培養基重懸，并添加 1.5ml 自體滅活血漿，轉移回原培養瓶中，置于 37℃、5%CO2的培養箱培養。 8. 第 4-6 天，每天觀察細胞，根據細胞懸液顏色或細胞密度（細胞濃度為 0.8-1×106/ml）添加培養基，每次添加體積不宜超過現有體積一倍。加液時按 4%、3%、2%的自體血漿加入 NK 細胞培養液。當培養液體積大于 60mL 則轉移至 T225 瓶中培養，置于 37℃、5% CO2的培養箱培養。 9. 第 7 天將培養的 NK 細胞輕輕吹勻，進行細胞計數，將 NK 細胞轉移到細胞培養袋中，加培養基使 NK 細胞濃度在 0.8-1.0×106cells/ml，血漿按 1%添加。添加試劑 A2 (37℃復蘇，然后用生理鹽水清洗一次，1400rpm 離心 5 分鐘之后再用 20ml NK 細胞無血清培養基重懸后加入到細胞培養袋中)，置于 37℃、5% CO2的培養箱培養； 10. 第 8-11 天每天觀察或計數，根據培養液顏色變化或細胞濃度添加培養液，血漿按 1%添加使得細胞濃度在 1×106cells/ml（隨著培養時間推移，細胞濃度可適量增加）。 11. 當細胞生長至所需數量時即可進行收集使用或凍存。一般情況下，12-13 天收集細胞最佳。 |
| 注意事項 | 1、 血液采集建議使用肝素鈉抗凝管或枸櫞酸鈉采血袋。 2、 自體血漿會影響細胞的培養狀態，建議自體血漿預留量為 30mL 左右。溶血、高脂肪可能會影響 NK 細胞的擴增。 3、 本試劑僅限用于以獲得自然殺傷細胞為目的的體外誘導處理，不同批次的試劑組分不能互換使用。 4、 如果試劑外包裝管出現裂縫，應立即停止使用。 5、 應嚴格按照貯存要求貯存。 6、 操作過程應在無菌環境下進行。必須保證操作過程中使用的所有容器及所有直接接觸細胞液的器具嚴格無菌。 7、 本試劑開封后必須一次性使用完畢，不得反復凍融。 8、 為保證本試劑活性，應嚴格按照常規細胞冷凍和復蘇的要求進行操作。細胞復蘇過程中嚴禁直接將凍存管全部浸沒在水浴內，建議至少應保證管蓋在水浴液面以上。 9、 細胞培養過程中，培養前 7 天出現細胞成團屬于正?，F象，操作過程請注意不要破壞細胞團。 |
| 聲明 | 僅用于科研使用，不能用于臨床診斷和治療。 |
| 保存條件 |
