| 適用范圍 | 試劑 |
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| 使用方法 | 豬空腸類器官完全培養基制備： 1. 提前將豬空腸類器官基礎培養基和豬空腸類器官添加物從-20℃取出，冰上放至融化。 2. 將豬空腸類器官添加物全部轉移到基礎培養基中，混合均勻，即為豬空腸類器官完全培養 基。 3. 對于原代標本的培養，可以取 10mL 配置好的完全培養基，加入 100μL Primary Enhancer，即可使用。 4. 對于非原代標本的培養，使用豬空腸類器官完全培養基即可。 豬來源空腸類器官構建： 1. 使用鑷子去除腸道外部的腸系膜、血管和脂肪，將腸段放入10cm培養皿中，培養皿置于 冰盒上，加入2mL預冷DPBS-PS，使用DPBS-PS 輕輕沖洗腸段。用剪刀將腸段縱向切開， 腸腔朝上打開，使用預冷DPBS-PS反復輕輕洗滌腸段至清洗液澄清。 *如新鮮標本無法立即處理，組織標本應浸泡在組織保存液中，建議使用組織運輸保存液， 冰上運輸盡快處理。 2. 準備裝有15mL預冷DPBS-PS的50mL離心管，用鑷子夾住腸段一端，懸掛于離心管口， 將腸段剪成2-5 mm小段，使腸段落入管內液體中。 3. 使用10mL移液管輕輕上下吹打腸道片段三次，靜置后輕輕吸出上清液，加入15mL預冷 DPBS-PS。重復上述步驟15-20次，直至上清液澄清。 4. 消化液配制：準備50mL DPBS-PS，加入100μL 腸類器官組織消化液（500×），現配現 用。 5. 清洗后的組織200g，離心3min，棄上清，向組織沉淀中加入腸類器官組織消化液25mL （1x)，搖床室溫消化15-20 min，取部分于顯微鏡下觀察腸隱窩情況。（該步驟的消化 時間可能會根據標本的情況進行調整） 6. 加入4mL DPBS-PS終止消化，200g，離心3min，棄上清，加入DPBS-PS重懸。 7. 準備一支裝有70μm濾網的50mL潔凈離心管，使用移液管將混懸液通過70μm濾網過濾 （可適當傾斜或輕微碰撞過濾器，使其快速過濾），以去除多余的絨毛，收集濾液。丟棄 濾網并將濾液放置于冰上，標記為“餾分1”。重復上述步驟，將組織片段重懸于10mL 預冷DPBS-PS中，濾網過濾后獲得餾分2-4，放置于冰上。 8. 在2-8℃下將各餾分290g，離心5min，棄上清液，將沉淀保留在每個管中。將各試管中 的沉淀重懸于10mL預冷DPBS-PS中，分別轉移到干凈的15mL離心管中，并標記對應的 餾分序號，在2-8℃下200 g，離心3min，棄上清，保留腸隱窩沉淀。 9. 用1mL DPBS-PS 重懸隱窩沉淀，取混懸液鏡下觀察，計數10μl樣本中隱窩數量后，離心 管于200g，離心5 min，棄上清。使用類器官培養基將隱窩密度重懸，按照0.8-2*104個 /mL的密度重懸于基質膠（BME或Matrigel）中（接種密度僅供參考，可按照實驗需求進 行調整）。將基質膠重懸后的隱窩接種至37℃預熱的細胞培養板中，注意槍尖不要接觸 至培養板的底部，膠滴應接種于培養孔的中心位置，若是24孔板，則每孔可接種50μL。 10.將接種好的培養板放置在37℃下靜置5 min后，倒置培養板靜置25 min，以待基質膠倒 置凝固。向每個孔中輕輕地加入500μL于37℃預熱的豬空腸類器官完全培養基。 11.將無菌DPBS-PS加至其它未接種液滴的孔中，以保持培養時的濕度，將培養板的蓋子蓋 上，并在37℃和5％CO2下進行培養。 12.鏡下觀察類器官的培養情況，3h后可觀察隱窩是否存活。建議適時進行換液或傳代（一 般建議每2-3天進行全換液或半換液）。一般在接種2-4 天開始出芽，5-7 天變成多裂狀。 在傳代前，確保大部分類器官的大小大于100μm。 豬來源空腸類器官傳代： 1. 將培養類器官的24孔板取出，用移液器去除培養基，加入2mL TrypLE，使用1mL槍頭將 膠滴吹散。可根據類器官量適量增加TrypLE的體積）室溫消化5-8 min，或37℃培養箱消 化5 min（避免消化過度，影響類器官生長）。 2. 將消化后的類器官懸液轉入6mL預冷的DPBS-PS中，可潤洗培養孔（需回收），保證培 養孔中的類器官都被收集起來。290 g，離心5min，棄上清，收集類器官。 3. 隱窩計數：將離心收集的類器官沉淀重懸于1mL DPBS-PS中，通過自動細胞計數板或者 手動計數板計出隱窩的個數，一個膠滴大約需要200-500隱窩(若隱窩狀態良好可進行1:3 傳代，若狀態較差可進行1:1傳代)。計數后，290g，離心5 min，棄上清，收集類器官。 4. 將獲取的隱窩沉淀根據計數結果重懸于基質膠（Matrigel）中。吸取50μL，并加入到提 前預熱的24孔板（提前預熱半小時）的中心部位。（不要將類器官接種到最外側的孔 中。） 5. 將接種好的培養板放置在37℃下靜置5min后，倒置培養板靜置25min，以待基質膠倒置 凝固。 6. 使用移液槍沿著孔側壁向每個孔中輕輕地加入500μL于37℃預熱的類器官完全培養基，請 勿將培養基直接加到膠滴上。將適量DPBS-PS 加至其它未接種液滴的孔中，以保持培養 時的濕度。 7. 蓋上培養板板蓋，并在37℃和5％CO2下進行培養。并每2-4 天進行一次培養基換液，觀 察生長情況，并進行拍照記錄，直至下次傳代。 注：所有接觸類器官的移液管、槍頭等類器官培養耗材均需進行潤洗，以免在傳代過程中 出現樣本的流失，使用抗粘附液效果更佳。 豬來源空腸類器官凍存： 1. 觀察類器官生長情況，當類器官活性良好，類器官大小大于200μm，每個膠滴內隱窩數 不低于150個時，即可進行凍存，類器官凍存量約為500個/管，若類器官數量較多時應注 意分管凍存。 2. 小心吸走培養孔中的培養基，加入適量 TrypLE，吹散膠滴，37℃培養箱，孵育3 min， 顯微鏡下觀察類器官消化情況，待類器官消化至40-60μm大小時，即可加入2-3倍消化液 體積DPBS-PS終止消化，200 g，離心5 min，棄上清；加入3mL DPBS-PS重懸，200g， 離心5 min，棄上清。 3. 加入類器官凍存液重懸沉淀，混合均勻后分裝至標記好的凍存管中，每管1mL；將凍存管 置于程序降溫盒中，進行梯度降溫：4℃（20 min），-20℃（2 h），-80℃（過夜）， 最后轉移至液氮罐。 |
| 注意事項 | 1. 本產品僅供科研使用，使用前請仔細閱讀本說明書。 2. 本產品僅適用于新鮮獲取或在組織保存液中保存 24 h 內的新鮮標本。 3. 本產品培養結果會受到標本質量、培養條件等因素影響，同時也受到技術員操作習慣、操 作環境以及當前細胞生物學技術局限性等限制，因此可能會存在培養失敗的情況。 4. 類器官完全培養基中不含有抗生素成分，請根據實驗需求自行添加。 5. 建議進行適當分裝，-20℃儲存，開封后，4℃保存使用，并于 5 周內用完，避免反復凍 融。 |
| 聲明 | 僅用于科研使用，不能用于臨床診斷和治療。 |
| 保存條件 | 豬空腸類器官基礎培養基：-20°C，12 個月；4°C，3個月 豬空腸類器官培養基添加物:-20°C，12 個月 |
