| 適用范圍 | 試劑 |
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| 使用方法 | 小鼠肺類器官完全培養基制備： 1. 試劑準備：提前將小鼠肺類器官基礎培養基和小鼠肺類器官添加物從-20℃取出，冰上放 至融化。 2. 完全培養基配制：將小鼠肺類器官培養基添加物全部轉移到基礎培養基中，混合均勻，即 為小鼠肺類器官完全培養基。 3. 原代標本培養：取 10mL 配置好的完全培養基，加入 100μL Primary Enhancer，即可使 用。 4. 維持培養：對于非原代標本的培養，使用小鼠肺類器官完全培養基即可。 小鼠來源肺類器官構建： 1. 樣本處理：將組織標本轉移到10cm培養皿中，培養皿置于冰盒上，加入10mL DPBS-PS， 清除多余組織。 *如新鮮標本無法立即處理，組織標本應浸泡在組織保存液中，建議使用組織運輸保存液， 冰上運輸盡快處理。 2. 樣本清洗：將標本使用DPBS-PS進行清洗，反復涮洗約5-10次，涮洗至清洗液澄清，去 除清洗液。 3. 消化前樣本準備：清洗完成后加入組織消化液Ⅰ約200μL。將標本剪切至0.5-1mm3的大 小，將切碎的組織轉移至15mL的離心管（用抗粘附液預先潤濕）中。 4. 消化階段Ⅰ：加入4mL 組織消化液Ⅰ，37℃搖床消化30-40 min，每隔15 min觀察是否 有大量的細胞漏出，該步驟的消化時間可能會根據標本的情況進行調整。當有細胞大量漏 出，且組織塊中大部分細胞已經被消化出來時，即可終止消化階段Ⅰ。 5. 終止消化階段Ⅰ：加入8mL DPBS-PS終止消化，300g，離心5 min，棄上清。 6. 消化階段Ⅱ：加入2mL 組織消化液Ⅱ，37℃，搖床消化10-15 min。鏡下觀察到大部分 細胞呈細胞團塊（＜200μm）既可終止消化階段Ⅱ（注：不要消化到單細胞狀態）。 7. 終止消化階段Ⅱ：加入8mL DPBS-PS終止消化，300g，離心5 min，棄上清。 8. 收集細胞：加入10mL DPBS-PS對細胞進行重懸，使用2mL 抗粘附液預先濕潤一個100 μm的細胞篩網，將細胞懸液使用該細胞篩網過濾，將濾出的濾液進行離心，300g，5 min，棄上清。 9. （可選步驟）如含較多紅細胞（細胞沉淀呈現紅色），加入紅細胞裂解液進行裂紅（具體 實驗方法參考產品說明書）后，300g，5 min，棄上清，使用1mL DPBS-PS重懸。 10.計數：通過自動細胞計數儀或者手動計數板計出細胞的個數。計數后，300g， 離心5 min，棄上清，收集細胞沉淀。 11.接種：將獲取的細胞沉淀，按照2-4*103細胞/μL的密度重懸于基質膠（BME或Matrigel） 中（接種密度僅供參考，可按照實驗需求進行調整）。將基質膠重懸后的細胞接種至37℃ 預熱的細胞培養板中，注意槍尖不要接種至培養板的底部，膠滴應接種于培養孔的中心位置，若是24孔板，則每孔可接種50μL。將接種好的培養板放置在37℃下靜置5 min后， 倒置培養板靜置25 min。 12.補液：使用移液槍沿著孔側壁向每個孔中輕輕地加入600μL于37℃預熱的類器官完全培養 基，請勿將培養基直接加到膠滴上。將1mL DPBS-PS均勻加至其它未接種液滴的孔中， 以保持培養時的濕度。 13.培養：將培養板的蓋子蓋上，并在37℃和5％CO2下進行培養。鏡下觀察類器官的培養情 況，適時進行換液或傳代（一般建議每2-3天進行全換液或半換液）。一般在接種3-4天 后，可觀測到類器官形成。 小鼠來源肺類器官傳代： 1. 傳代標準：在傳代前，確保大部分類器官的大小大于100μm。 2. 消化：將培養類器官的24孔板取出，用移液器去除培養基，每孔加入0.5mL TrypLE，使 用1mL槍頭將膠滴吹散（可根據類器官量適量增加TrypLE的體積）。室溫消化5-8 min， 或37℃培養箱消化5min（避免消化過度，影響類器官生長），顯微鏡下觀察類器官消化 情況，待大部分類器官消化至40-60μm大小時，即可加入2倍消化液體積的DPBS-PS終 止消化。 3. 收集類器官：將消化后的類器官懸液轉入離心管中（可用抗粘附液預先潤濕離心管），保 證培養孔中的類器官都被收集起來。300g，離心5 min，去上清，收集類器官，使用 1mL DPBS-PS重懸。 4. 計數：通過自動細胞計數板或者手動計數板計出細胞的個數。計數后，300g， 離心5 min，去上清，收集類器官。 5. 接種：將獲取的類器官沉淀，根據計數結果重懸于基質膠（Matrigel）中，一個膠滴大約 需要200-500個細胞團（約2-5萬個細胞）。吸取50μL細胞懸液，并加入到提前預熱的24 孔板（提前預熱半小時）的中心部位。（不要將類器官接種到最外側的孔中。）將接種好 的培養板放置在37℃下靜置5min后，倒置培養板靜置25 min，以待基質膠倒置凝固。 6. 補液：使用移液槍沿著孔側壁向每個孔中輕輕地加入600μL于37℃預熱的類器官完全培養 基，請勿將培養基直接加到膠滴上。將1mL DPBS-PS均勻加至其它未接種液滴的孔中， 以保持培養時的濕度。 7. 培養：蓋上培養板板蓋，并在37℃和5％CO2下進行培養。每2-4天進行一次全換液，觀 察生長情況，并進行拍照記錄，直至下次傳代。 注：所有接觸類器官的移液管、槍頭等類器官培養耗材均需進行潤洗，以免在傳代過程中 出現樣本的流失，使用抗粘附液效果更佳。 小鼠來源肺類器官凍存： 1. 凍存標準：觀察類器官生長情況，當類器官活性良好，大部分類器官的大小大于100μm 時，即可進行凍存。 2. 消化：小心吸走培養孔中的培養基，每孔加入0.5mL TrypLE，吹散膠滴，37℃培養箱， 孵育3min，顯微鏡下觀察類器官消化情況，待類器官消化至40-60μm大小時，即可加入 2倍消化液體積的DPBS-PS終止消化。 3. 收集類器官：將消化后的類器官懸液轉入離心管中（可用抗粘附液預先潤濕離心管），保 證培養孔中的類器官都被收集起來。300g，離心5min，棄上清；加入3mL DPBS-PS重 懸細胞，300g，離心5 min，棄上清，使用1mL DPBS-PS重懸。 4. 計數：通過自動細胞計數板或者手動計數板計出細胞的個數。計數后，300g， 離心5 min，去上清，收集類器官。 5. 凍存：根據類器官計數結果，加入適量類器官凍存液重懸沉淀，混合均勻后分裝至標記好 的凍存管中，類器官每管凍存細胞量約為5*105個，每管1mL，若細胞量較多時應注意分 管凍存；將凍存管置于程序降溫盒中，-80℃過夜保存（或進行梯度降溫，4℃放置 20min，-20℃放置2h，-80℃放置過夜），最后轉移至液氮罐。 |
| 注意事項 | 1. 本產品僅供科研使用，使用前請仔細閱讀本說明書。 2. 本產品僅適用于新鮮獲取或在組織保存液中保存 24 h 內的新鮮標本。 3. 本產品培養結果會受到標本質量、培養條件等因素影響，同時也受到技術員操作習慣、操 作環境以及當前細胞生物學技術局限性等限制，因此可能會存在培養失敗的情況。 4. 類器官完全培養基中不含有抗生素成分，請根據實驗需求自行添加。 5. 建議進行適當分裝，-20℃儲存，開封后，4℃保存使用，并于 2 周內用完，避免反復凍 融。 |
| 聲明 | 僅用于科研使用，不能用于臨床診斷和治療。 |
| 保存條件 | 小鼠肺類器官基礎培養基：-20°C，12 個月；4°C，3個月 小鼠肺類器官培養基添加物:-20°C，12 個月 |
