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小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基

產(chǎn)品貨號3D334-100
產(chǎn)品規(guī)格100ml
目錄價格 ￥4092.00 元
產(chǎn)品編號3D334-100
百迪全線產(chǎn)品僅供科研使用
產(chǎn)品信息
適用范圍 試劑
使用方法 小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基制備：
1. 提前將小鼠小腸類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基和小鼠小腸類器官添加物從-20℃取出，冰上放至融化。
2. 將小鼠小腸類器官添加物全部轉(zhuǎn)移到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，混合均勻，即為小鼠小腸類器官完全 培養(yǎng)基。
3. 對于原代標本的培養(yǎng)，可以取 10mL 配置好的完全培養(yǎng)基，加入 100μL Primary Enhancer，即可使用。
4. 對于非原代標本的培養(yǎng)，使用小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基即可。
小鼠來源小腸類器官構(gòu)建：
1. 使用鑷子去除腸道外部的腸系膜、血管和脂肪，將腸段放入10cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿置于 冰盒上，加入2mL預(yù)冷DPBS-PS，使用DPBS-PS 輕輕沖洗腸段。用剪刀將腸段縱向切開， 腸腔朝上打開，使用預(yù)冷DPBS-PS反復(fù)輕輕洗滌腸段至清洗液澄清。
*如新鮮標本無法立即處理，組織標本應(yīng)浸泡在組織保存液中，建議使用組織運輸保存液， 冰上運輸盡快處理。
2. 準備裝有15mL預(yù)冷DPBS-PS的50mL離心管，用鑷子夾住腸段一端，懸掛于離心管口， 將腸段剪成2-5 mm小段，使腸段落入管內(nèi)液體中。
3. 使用10mL移液管輕輕上下吹打腸道片段三次，靜置后輕輕吸出上清液，加入15mL預(yù)冷 DPBS-PS。重復(fù)上述步驟15-20次，直至上清液澄清。
4. 消化液配制：準備50mL DPBS-PS，加入100μL 腸類器官組織消化液（500×），現(xiàn)配現(xiàn) 用。
5. 清洗后的組織200g，離心3min，棄上清，向組織沉淀中加入腸類器官組織消化液25mL （1x)，搖床室溫消化15-20 min，取部分于顯微鏡下觀察腸隱窩情況。（該步驟的消化 時間可能會根據(jù)標本的情況進行調(diào)整）
6. 加入4mL DPBS-PS終止消化，200g，離心3 min，棄上清，加入DPBS-PS重懸。
7. 準備一支裝有70μm濾網(wǎng)的50mL潔凈離心管，使用移液管將混懸液通過70μm濾網(wǎng)過濾 （可適當傾斜或輕微碰撞過濾器，使其快速過濾），以去除多余的絨毛，收集濾液。丟棄 濾網(wǎng)并將濾液放置于冰上，標記為“餾分1”。重復(fù)上述步驟，將組織片段重懸于10mL 預(yù)冷DPBS-PS中，濾網(wǎng)過濾后獲得餾分2-4，放置于冰上。
8. 在2-8℃下將各餾分290g，離心5 min，棄上清液，將沉淀保留在每個管中。將各試管中 的沉淀重懸于10mL預(yù)冷DPBS-PS中，分別轉(zhuǎn)移到干凈的15mL離心管中，并標記對應(yīng)的 餾分序號，在2-8℃下200g，離心3min，棄上清，保留腸隱窩沉淀。
9. 用1mL DPBS-PS 重懸隱窩沉淀，取混懸液鏡下觀察，計數(shù)10μl樣本中隱窩數(shù)量后，離心 管于200g，離心5 min，棄上清。使用類器官培養(yǎng)基將隱窩密度重懸，按照0.8-2*104個 /mL的密度重懸于基質(zhì)膠（BME或Matrigel）中（接種密度僅供參考，可按照實驗需求進 行調(diào)整）。將基質(zhì)膠重懸后的隱窩接種至37℃預(yù)熱的細胞培養(yǎng)板中，注意槍尖不要接觸 至培養(yǎng)板的底部，膠滴應(yīng)接種于培養(yǎng)孔的中心位置，若是24孔板，則每孔可接種50μL。
10.將接種好的培養(yǎng)板放置在37℃下靜置5 min后，倒置培養(yǎng)板靜置25 min，以待基質(zhì)膠倒 置凝固。向每個孔中輕輕地加入500μL于37℃預(yù)熱的小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基。
11.將無菌DPBS-PS加至其它未接種液滴的孔中，以保持培養(yǎng)時的濕度，將培養(yǎng)板的蓋子蓋 上，并在37℃和5％CO2下進行培養(yǎng)。
12.鏡下觀察類器官的培養(yǎng)情況，3h后可觀察隱窩是否存活。建議適時進行換液或傳代（一 般建議每2-3天進行全換液或半換液）。一般在接種2-4 天開始出芽，5-7 天變成多裂狀。 在傳代前，確保大部分類器官的大小大于100μm。
小鼠來源小腸類器官傳代：
1. 將培養(yǎng)類器官的24孔板取出，用移液器去除培養(yǎng)基，加入2mL TrypLE，使用1mL槍頭將 膠滴吹散。可根據(jù)類器官量適量增加TrypLE的體積）室溫消化5-8 min，或37℃培養(yǎng)箱消 化5 min（避免消化過度，影響類器官生長）。
2. 將消化后的類器官懸液轉(zhuǎn)入6mL預(yù)冷的DPBS-PS中，可潤洗培養(yǎng)孔（需回收），保證培 養(yǎng)孔中的類器官都被收集起來。290g，離心5min，棄上清，收集類器官。
3. 隱窩計數(shù)：將離心收集的類器官沉淀重懸于1mL DPBS-PS中，通過自動細胞計數(shù)板或者 手動計數(shù)板計出隱窩的個數(shù)，一個膠滴大約需要200-500隱窩(若隱窩狀態(tài)良好可進行1:3 傳代，若狀態(tài)較差可進行1:1傳代)。計數(shù)后，290g， 離心5 min，棄上清，收集類器官。
4. 將獲取的隱窩沉淀根據(jù)計數(shù)結(jié)果重懸于基質(zhì)膠（Matrigel）中。吸取50μL，并加入到提 前預(yù)熱的24孔板（提前預(yù)熱半小時）的中心部位。（不要將類器官接種到最外側(cè)的孔 中。）
5. 將接種好的培養(yǎng)板放置在37℃下靜置5 min后，倒置培養(yǎng)板靜置25 min，以待基質(zhì)膠倒 置凝固。
6. 使用移液槍沿著孔側(cè)壁向每個孔中輕輕地加入500μL于37℃預(yù)熱的類器官完全培養(yǎng)基，請 勿將培養(yǎng)基直接加到膠滴上。將適量DPBS-PS 加至其它未接種液滴的孔中，以保持培養(yǎng) 時的濕度。
7. 蓋上培養(yǎng)板板蓋，并在37℃和5％CO2下進行培養(yǎng)。并每2-4 天進行一次培養(yǎng)基換液，觀 察生長情況，并進行拍照記錄，直至下次傳代。
注：所有接觸類器官的移液管、槍頭等類器官培養(yǎng)耗材均需進行潤洗，以免在傳代過程中 出現(xiàn)樣本的流失，使用抗粘附液效果更佳。
小鼠來源小腸類器官凍存：
1. 觀察類器官生長情況，當類器官活性良好，類器官大小大于200μM，每個膠滴內(nèi)隱窩數(shù) 不低于150個時，即可進行凍存，類器官凍存量約為500個/管，若類器官數(shù)量較多時應(yīng)注 意分管凍存。
2. 小心吸走培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基，加入適量 TrypLE，吹散膠滴，37℃培養(yǎng)箱，孵育3 min， 顯微鏡下觀察類器官消化情況，待類器官消化至40-60μm大小時，即可加入2-3倍消化液 體積DPBS-PS終止消化，200g，離心5 min，棄上清；加入3mL DPBS-PS重懸，200g， 離心5 min，棄上清。
3. 加入類器官凍存液重懸沉淀，混合均勻后分裝至標記好的凍存管中，每管1mL；將凍存管 置于程序降溫盒中，進行梯度降溫：4℃（20 min），-20℃（2 h），-80℃（過夜）， 最后轉(zhuǎn)移至液氮罐。
注意事項 1. 本產(chǎn)品僅供科研使用，使用前請仔細閱讀本說明書。
2. 本產(chǎn)品僅適用于新鮮獲取或在組織保存液中保存 24 h 內(nèi)的新鮮標本。
3. 本產(chǎn)品培養(yǎng)結(jié)果會受到標本質(zhì)量、培養(yǎng)條件等因素影響，同時也受到技術(shù)員操作習(xí)慣、操 作環(huán)境以及當前細胞生物學(xué)技術(shù)局限性等限制，因此可能會存在培養(yǎng)失敗的情況。
4. 類器官完全培養(yǎng)基中不含有抗生素成分，請根據(jù)實驗需求自行添加。
5. 建議進行適當分裝，-20℃儲存，開封后，4℃保存使用，并于 2 周內(nèi)用完，避免反復(fù)凍 融。
聲明 僅用于科研使用，不能用于臨床診斷和治療。
保存條件 小鼠小腸類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基：-20°C，12 個月；4°C，3個月
小鼠小腸類器官培養(yǎng)基添加物:-20°C，12 個月
產(chǎn)品詳情
BDBIO 小鼠小腸類器官培養(yǎng)體系模擬了細胞體內(nèi)生長的微環(huán)境，極大程度維持了來源于體內(nèi) 小腸組織的特征。小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基適用于小鼠小腸組織來源類器官的構(gòu)建、維持 培養(yǎng)及傳代擴增。