| 適用范圍 | 試劑 |
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| 使用方法 | 人小腸類器官完全培養基制備 1. 試劑準備：提前將小腸類器官基礎培養基和小腸類器官添加物從-20℃取出，冰上放至融 化。 2. 完全培養基配制：將人小腸類器官培養基添加物全部轉移到基礎培養基中，混合均勻。 3. 原代標本培養：取 10mL 配置好的完全培養基，加入 100μL Primary Enhancer，即可使 用。 4. 維持培養：對于非原代標本的培養，使用人小腸類器官完全培養基即可。 人來源的小腸類器官構建： 1. 使用鑷子去除腸道外部的腸系膜、血管和脂肪，將腸段放入 10cm 培養皿中，培養皿置于 冰盒上，加入 2mL 預冷 DPBS-PS，使用 DPBS-PS 輕輕沖洗腸段。用剪刀將腸段縱向切 開，腸腔朝上打開，使用預冷 DPBS-PS 反復輕輕洗滌腸段至清洗液澄清。如新鮮標本無 法立即處理，組織標本應浸泡在組織保存液中，冰上運輸盡快處理。 2. 準備裝有 15mL 預冷 DPBS-PS 的 50mL 離心管，用鑷子夾住腸段一端，懸掛于離心管口， 將腸段剪成 2-5mm 小段，使腸段落入管內液體中。 3. 使用 10mL 移液管輕輕上下吹打腸道片段三次，靜置后輕輕吸出上清液，加入 15mL 預 冷 DPBS-PS。重復上述步驟 15-20 次，直至上清液澄清。 4. 清洗后的組織 200g，離心 3min，棄上清，向組織沉淀中加入團塊解離消化液 25mL， 搖床室溫消化 15-20min，取部分于顯微鏡下觀察腸隱窩情況。（該步驟的消化時間可能 會根據標本的情況進行調整） 5. 加入 4 mL DPBS-PS 終止消化，200g，離心 3min，棄上清，加入 DPBS-PS 重懸。 6. 準備一支裝有 70μm 濾網的 50mL 潔凈離心管，使用移液管將混懸液通過 70μm 濾網過 濾（可適當傾斜或輕微碰撞過濾器，使其快速過濾），以去除多余的絨毛，收集濾液。丟 棄濾網并將濾液放置于冰上，標記為“餾分 1”。重復上述步驟，將組織片段重懸于 10mL 預冷 DPBS-PS 中，濾網過濾后獲得餾分 2-4，放置于冰上。 7. 在 2–8℃下將各餾分 290g，離心 5min，棄上清液，將沉淀保留在每個管中。將各試管 中的沉淀重懸于 10mL 預冷 DPBS-PS 中，分別轉移到干凈的 15mL 離心管中，并標記對 應的餾分序號，在 2–8℃下 200g，離心 3min，棄上清，保留腸隱窩沉淀。 8. 用 1mL DPBS-PS 重懸隱窩沉淀，取混懸液鏡下觀察，計數 10μl 樣本中隱窩數量后，離 心管于 200g，離心 5min，棄上清。使用類器官培養基將隱窩密度重懸，按照 0.8-2*104 個/mL 的密度重懸于基質膠（BME 或 Matrigel）中（接種密度僅供參考，可按照實驗需 求進行調整）。將基質膠重懸后的隱窩接種至 37℃預熱的細胞培養板中，注意槍尖不要 接觸至培養板的底部，膠滴應接種于培養孔的中心位置，若是 24 孔板，則每孔可接種 50 μL。 9. 將接種好的培養板放置在 37℃下靜置 5min 后，倒置培養板靜置 25min，以待基質膠倒 置凝固。向每個孔中輕輕地加入 500μL 于 37℃預熱的人小腸類器官完全培養基。 10.將無菌 DPBS-PS 加至其它未接種液滴的孔中，以保持培養時的濕度，將培養板的蓋子蓋 上，并在 37℃和 5％CO2 下進行培養。 11.鏡下觀察類器官的培養情況，3h 后可觀察隱窩是否存活。建議適時進行換液或傳代（一 般建議每 2-3 天進行全換液或半換液）。一般在接種 2-4 天開始出芽，5-7 天變成多裂狀。 在傳代前，確保大部分類器官的大小大于 100μm。 人來源的小腸類器官傳代： 1. 將培養類器官的 24 孔板取出，用移液器去除培養基，加入 2mL TrypLE，使用 1mL 槍頭 將膠滴吹散。可根據類器官量適量增加 TrypLE 的體積）室溫消化 5-8 min，或 37℃培養 箱消化 5 min（避免消化過度，影響類器官生長）。 2. 將消化后的類器官懸液轉入 6mL 預冷的 DPBS-PS 中，可潤洗培養孔（需回收），保證 培養孔中的類器官都被收集起來。290g，離心 5 min，棄上清，收集類器官。 3. 隱窩計數：將離心收集的類器官沉淀重懸于 1mL DPBS-PS 中，通過自動細胞計數板或者 手動計數板計出隱窩的個數，一個膠滴大約需要 200-500 隱窩(若隱窩狀態良好可進行 1:3 傳代，若狀態較差可進行 1:1 傳代)。計數后，290g，離心 5 min，棄上清，收集類 器官。 4. 將獲取的隱窩沉淀根據計數結果重懸于基質膠（Matrigel）中。吸取 50μL，并加入到提 前預熱的 24 孔板（提前預熱半小時）的中心部位。（不要將類器官接種到最外側的孔 中。） 5. 將接種好的培養板放置在 37℃下靜置 5min 后，倒置培養板靜置 25 min，以待基質膠倒 置凝固。 6. 使用移液槍沿著孔側壁向每個孔中輕輕地加入 500μL 于 37℃預熱的類器官完全培養基， 請勿將培養基直接加到膠滴上。將適量 DPBS-PS 加至其它未接種液滴的孔中，以保持培 養時的濕度。 7. 蓋上培養板板蓋，并在 37℃和 5％CO2 下進行培養。并每 2–4 天進行一次培養基換液， 觀察生長情況，并進行拍照記錄，直至下次傳代。 注：所有接觸類器官的移液管、槍頭等類器官培養耗材均需進行潤洗，以免在傳代過程中 出現樣本的流失，使用抗粘附液效果更佳。 人來源的小腸類器官凍存： 1. 觀察類器官生長情況，當類器官活性良好，類器官大小大于 200μM，每個膠滴內隱窩數 不低于 150 個時，即可進行凍存，類器官凍存量約為 500 個/管，若類器官數量較多時應 注意分管凍存。 2. 小心吸走培養孔中的培養基，加入適量 TrypLE，吹散膠滴，37℃培養箱，孵育 3 min， 顯微鏡下觀察類器官消化情況，待類器官消化至 40-60μm 大小時，即可加入 2-3 倍消化 液體積 DPBS-PS 終止消化，200g，離心 5 min，棄上清；加入 3mL DPBS-PS 重懸， 200g，離心 5 min，棄上清。 3. 加入類器官凍存液重懸沉淀，混合均勻后分裝至標記好的凍存管中，每管 1mL；將凍存 管置于程序降溫盒中，進行梯度降溫：4℃（20min），-20℃（2h），-80℃（過夜）， 最后轉移至液氮罐。 |
| 注意事項 | 1. 本產品使用過程中應注意無菌操作，避免污染。 2. 本產品僅適用于新鮮獲取或在組織保存液中保存 24h 內的新鮮標本。 3. 本產品培養結果會受到標本質量、培養條件等因素影響，同時也受到技術員操作習慣、操 作環境以及當前細胞生物學技術局限性等限制，因此可能會存在培養失敗的情況。 4. 類器官完全培養基中不含有抗生素成分，請根據實驗需求自行添加，推薦工作濃度為 1%。 5. 建議進行適當分裝，-20℃儲存，開封后，4℃保存使用，并于 2 周內用完，避免反復凍 融。 |
| 聲明 | 僅用于科研使用，不能用于臨床診斷和治療。 |
| 保存條件 | 人小腸類器官基礎培養基：-20°C，12 個月；4°C，3個月 人小腸類器官培養基添加物:-20°C，12 個月 |
