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人小細(xì)胞肺癌類器官培養(yǎng)試劑盒

產(chǎn)品貨號3D305-Kit
產(chǎn)品規(guī)格kit
目錄價(jià)格 ￥6732.00 元
產(chǎn)品編號3D305-Kit
百迪全線產(chǎn)品僅供科研使用
產(chǎn)品信息
適用范圍 試劑
使用方法 患者小細(xì)胞肺癌組織運(yùn)輸：
將新鮮組織標(biāo)本置于標(biāo)本儲存管中（注：組織塊太大將影響組織運(yùn)輸保存液中營養(yǎng)物質(zhì)的交 換，影響標(biāo)本活性，需將組織標(biāo)本修剪至體積約為 0.5cm3），加入足量組織運(yùn)輸保存液浸沒 組織，于 2-8℃運(yùn)輸，盡快運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。
人小細(xì)胞肺癌類器官完全培養(yǎng)基制備：
1. 試劑準(zhǔn)備：提前將小細(xì)胞肺癌類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基和小細(xì)胞肺癌類器官添加物從-20℃取出， 冰上放至融化。
2. 完全培養(yǎng)基配制：將小細(xì)胞肺癌類器官培養(yǎng)基添加物全部轉(zhuǎn)移到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，混合均勻， 即為小細(xì)胞肺癌類器官完全培養(yǎng)基。
3. 原代標(biāo)本培養(yǎng)：取 10mL 配置好的完全培養(yǎng)基，加入 100μL Primary Enhancer，即可使 用。
4. 維持培養(yǎng)：對于非原代標(biāo)本的培養(yǎng)，使用小細(xì)胞肺癌類器官完全培養(yǎng)基即可。
患者來源的小細(xì)胞肺癌類器官構(gòu)建:
1. 樣本處理：將組織標(biāo)本轉(zhuǎn)移到 10cm 培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿置于冰盒上，加入 10mL DPBS[1]PS，清除多余組織，僅保留病灶。
2. 樣本清洗：將標(biāo)本使用 DPBS-PS 進(jìn)行清洗，反復(fù)涮洗約 5-10 次，涮洗至清洗液澄清， 去除清洗液。
3. 消化前樣本準(zhǔn)備：清洗完成后加入組織消化液Ⅰ約 200μL。將標(biāo)本剪切至 0.5-1mm3 的 大小，將切碎的組織轉(zhuǎn)移至 15mL 的離心管（用抗粘附液預(yù)先潤濕）中。
4. 消化階段Ⅰ：加入 4mL 組織消化液Ⅰ，37℃搖床消化 30-40 min，每隔 15min 觀察是 否有大量的細(xì)胞漏出，該步驟的消化時間可能會根據(jù)標(biāo)本的情況進(jìn)行調(diào)整。當(dāng)有細(xì)胞大量 漏出，且組織塊中大部分細(xì)胞已經(jīng)被消化出來時，即可終止消化階段Ⅰ。
5. 終止消化階段Ⅰ：加入 8mL DPBS-PS 終止消化，300g，離心 5min，棄上清。
6. 消化階段Ⅱ：加入 2mL 組織消化液Ⅱ，37℃，搖床消化 10-15min。鏡下觀察到大部分 細(xì)胞呈細(xì)胞團(tuán)塊（＜200μm）既可終止消化階段Ⅱ（注：不要消化到單細(xì)胞狀態(tài)）。
7. 終止消化階段Ⅱ：加入 8mL DPBS-PS 終止消化，300g，離心 5min，棄上清。
8. 收集細(xì)胞：加入 10mL DPBS-PS 對細(xì)胞進(jìn)行重懸，使用 2mL 抗粘附液預(yù)先濕潤一個 100μm 的細(xì)胞篩網(wǎng)，將細(xì)胞懸液使用該細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，將濾出的濾液進(jìn)行離心，300g, 離心 5min，棄上清。
9. （可選步驟）如含較多紅細(xì)胞（細(xì)胞沉淀呈現(xiàn)紅色），加入紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂紅（具體 實(shí)驗(yàn)方法參考產(chǎn)品說明書）后，300g，5min，棄上清，使用 1mL DPBS-PS 重懸。
10.計(jì)數(shù)：通過自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或者手動計(jì)數(shù)板計(jì)出細(xì)胞的個數(shù)。計(jì)數(shù)后，300g,離心 5min， 棄上清，收集細(xì)胞沉淀。
11.接種：將獲取的細(xì)胞沉淀，按照 2-4*103 細(xì)胞/μL 的密度重懸于基質(zhì)膠（BME 或 Matrigel）中（接種密度僅供參考，可按照實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行調(diào)整）。將基質(zhì)膠重懸后的細(xì)胞 接種至 37℃預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)板中，注意槍尖不要接種至培養(yǎng)板的底部，膠滴應(yīng)接種于培 養(yǎng)孔的中心位置，若是 24 孔板，則每孔可接種 50μL。將接種好的培養(yǎng)板放置在 37℃下 靜置 5min 后，倒置培養(yǎng)板靜置 25min。
12.補(bǔ)液：使用移液槍沿著孔側(cè)壁向每個孔中輕輕地加入 600μL 于 37℃預(yù)熱的腫瘤類器官完 全培養(yǎng)基，請勿將培養(yǎng)基直接加到膠滴上。將 1mL DPBS-PS 均勻加至其它未接種液滴的 孔中，以保持培養(yǎng)時的濕度。
13.培養(yǎng)：將培養(yǎng)板的蓋子蓋上，并在 37℃和 5％CO2 下進(jìn)行培養(yǎng)。鏡下觀察類器官的培養(yǎng) 情況，適時進(jìn)行換液或傳代（一般建議每 2-3 天進(jìn)行全換液或半換液）。一般在接種 3-4 天后，可觀測到類器官形成。
患者來源的小細(xì)胞肺癌類器官傳代：
1. 傳代標(biāo)準(zhǔn)：在傳代前，確保大部分類器官的大小大于 100μm。
2. 消化：將培養(yǎng)類器官的 24 孔板取出，用移液器去除培養(yǎng)基，每孔加入 0.5mL TrypLE， 使用 1mL 槍頭將膠滴吹散（可根據(jù)類器官量適量增加 TrypLE 的體積）。室溫消化 5-8 min，或 37℃培養(yǎng)箱消化 5min（避免消化過度，影響類器官生長），顯微鏡下觀察類器 官消化情況，待大部分類器官消化至 40-60μm 大小時，即可加入 2 倍消化液體積的 DPBS-PS 終止消化。
3. 收集類器官：將消化后的類器官懸液轉(zhuǎn)入離心管中（可用抗粘附液預(yù)先潤濕離心管），保 證培養(yǎng)孔中的類器官都被收集起來。300g，離心 5min，去上清，收集類器官，使用 1mL DPBS-PS 重懸。
4. 計(jì)數(shù)：通過自動細(xì)胞計(jì)數(shù)板或者手動計(jì)數(shù)板計(jì)出細(xì)胞的個數(shù)。計(jì)數(shù)后，300g，離心 5min， 去上清，收集類器官。
5. 接種：將獲取的類器官沉淀，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果重懸于基質(zhì)膠（Matrigel）中，一個膠滴大約 需要 200-500 個細(xì)胞團(tuán)（約 2–5 萬個細(xì)胞）。吸取 50μL 細(xì)胞懸液，并加入到提前預(yù)熱 的 24 孔板（提前預(yù)熱半小時）的中心部位。（不要將類器官接種到最外側(cè)的孔中）將接 種好的培養(yǎng)板放置在 37℃下靜置 5min 后，倒置培養(yǎng)板靜置 25min，以待基質(zhì)膠倒置凝 固。
6. 補(bǔ)液：使用移液槍沿著孔側(cè)壁向每個孔中輕輕地加入 600μL 于 37℃預(yù)熱的腫瘤類器官完 全培養(yǎng)基，請勿將培養(yǎng)基直接加到膠滴上。將 1mL DPBS-PS 均勻加至其它未接種液滴的 孔中，以保持培養(yǎng)時的濕度。
7. 培養(yǎng)：蓋上培養(yǎng)板板蓋，并在 37℃和 5％CO2 下進(jìn)行培養(yǎng)。每 2-4 天進(jìn)行一次全換液， 觀察生長情況，并進(jìn)行拍照記錄，直至下次傳代。
注：所有接觸類器官的移液管、槍頭等類器官培養(yǎng)耗材均需進(jìn)行潤洗，以免在傳代過程中 出現(xiàn)樣本的流失，推薦使用抗粘附液效果更佳。
患者來源的小細(xì)胞肺癌類器官凍存：
1. 凍存標(biāo)準(zhǔn)：觀察類器官生長情況，當(dāng)類器官活性良好，大部分類器官的大小大于 100μm 時，即可進(jìn)行凍存。
2. 消化：小心吸走培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基，每孔加入 0.5mL TrypLE，吹散膠滴，37℃培養(yǎng)箱， 孵育 3min，顯微鏡下觀察類器官消化情況，待類器官消化至 40-60μm 大小時，即可加 入 2 倍消化液體積的 DPBS-PS 終止消化。
3. 收集類器官：將消化后的類器官懸液轉(zhuǎn)入離心管中（可用抗粘附液預(yù)先潤濕離心管），保 證培養(yǎng)孔中的類器官都被收集起來。300g，離心 5min，棄上清；加入 3mL DPBS-PS 重 懸細(xì)胞，300g，離心 5min，棄上清，使用 1mL DPBS-PS 重懸。
4. 計(jì)數(shù)：通過自動細(xì)胞計(jì)數(shù)板或者手動計(jì)數(shù)板計(jì)出細(xì)胞的個數(shù)。計(jì)數(shù)后，300g，離心 5min， 去上清，收集類器官。
5. 凍存：根據(jù)類器官計(jì)數(shù)結(jié)果，加入適量類器官凍存液重懸沉淀，混合均勻后分裝至標(biāo)記好 的凍存管中，類器官每管凍存細(xì)胞量約為 5*105 個，每管 1mL，若細(xì)胞量較多時應(yīng)注意 分管凍存；將凍存管置于程序降溫盒中，-80℃過夜保存（或進(jìn)行梯度降溫，4℃放置 20min，-20℃放置 2h，-80℃放置過夜），最后轉(zhuǎn)移至液氮罐。
注意事項(xiàng) 1. 本試劑盒僅供科研使用，使用前請仔細(xì)閱讀本說明書。
2. 本試劑盒僅適用于經(jīng)細(xì)胞學(xué)或組織病理學(xué)確認(rèn)的實(shí)體瘤組織標(biāo)本或胸腹水的小細(xì)胞肺癌類 器官培養(yǎng)。
3. 本試劑盒培養(yǎng)結(jié)果會受到標(biāo)本質(zhì)量、培養(yǎng)條件等因素影響，同時也受到技術(shù)員操作習(xí)慣、 操作環(huán)境以及當(dāng)前細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)局限性等限制，因此可能會存在培養(yǎng)失敗的情況。
4. 類器官完全培養(yǎng)基中不含有抗生素成分，請根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求自行添加，推薦工作濃度為 1%。
5. 建議進(jìn)行適當(dāng)分裝，-20℃儲存，開封后，4℃保存使用，并于 2 周內(nèi)用完，避免反復(fù)凍 融。
聲明 僅用于科研使用，不能用于臨床診斷和治療。
保存條件 小細(xì)胞肺癌類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基:-20°C，12 個月；4°C，3個月
小細(xì)胞肺癌類器官培養(yǎng)基添加物:-20°C，12 個月
組織運(yùn)輸保存液:-20°C，12 個月；4℃，2 周
類器官凍存液:4°C，12 個月
組織消化液Ⅰ:-20°C，12 個月；4℃，2 周
組織消化液Ⅱ:-20°C，12 個月；4℃，2 周
Primary Enhancer:-20°C，12 個月
產(chǎn)品詳情
人小細(xì)胞肺癌類器官培養(yǎng)體系模擬了腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長的微環(huán)境，極大程度維持了來源于體 內(nèi)腫瘤組織的特征，保留了個體之間的腫瘤異質(zhì)性。人小細(xì)胞肺癌類器官培養(yǎng)試劑盒適用于 患者來源小細(xì)胞肺癌類器官的構(gòu)建、維持培養(yǎng)及傳代擴(kuò)增，可支持多種亞型及多種分期的小 細(xì)胞肺癌類器官。本試劑盒包括從組織運(yùn)輸?shù)筋惼鞴贅?gòu)建、擴(kuò)增及凍存的全套試劑，優(yōu)化了 實(shí)驗(yàn)步驟，提高類器官構(gòu)建效率。