| 適用范圍 | 試劑 |
|---|---|
| 使用方法 | 患者肺癌組織運輸： 將新鮮組織標本置于標本儲存管中（注：組織塊太大將影響組織運輸保存液中營養物質的交 換，影響標本活性，需將組織標本修剪至體積約為 0.5cm3），加入足量組織運輸保存液浸沒 組織，于 2-8℃運輸，盡快運輸至實驗室進行處理。 肺癌類器官完全培養基制備： 1. 試劑準備：提前將肺癌類器官基礎培養基和肺癌類器官添加物從-20℃取出，冰上放至融 化。 2. 完全培養基配制：將肺癌類器官培養基添加物全部轉移到基礎培養基中，混合均勻，即為 肺癌類器官完全培養基。 3. 原代標本培養：取 10mL 配置好的完全培養基，加入 100μL Primary Enhancer，即可使 用。 4. 維持培養：對于非原代標本的培養，使用肺癌類器官完全培養基即可。 患者來源的肺癌類器官構建: 1. 樣本處理：將組織標本轉移到 10cm 培養皿中，培養皿置于冰盒上，加入 10mL DPBS[1]PS，清除多余組織，僅保留病灶。 2. 樣本清洗：將標本使用 DPBS-PS 進行清洗，反復涮洗約 5-10 次，涮洗至清洗液澄清， 去除清洗液。 3. 消化前樣本準備：清洗完成后加入組織消化液Ⅰ約 200μL。將標本剪切至 0.5-1mm3 的 大小，將切碎的組織轉移至 15mL 的離心管（用抗粘附液預先潤濕）中。 4. 消化階段Ⅰ：加入 4mL 組織消化液Ⅰ，37℃搖床消化 30-40min，每隔 15min 觀察是否 有大量的細胞漏出，該步驟的消化時間可能會根據標本的情況進行調整。當有細胞大量漏 出，且組織塊中大部分細胞已經被消化出來時，即可終止消化階段Ⅰ。 5. 終止消化階段Ⅰ：加入 8mL DPBS-PS 終止消化，300g，離心 5min，棄上清。 6. 消化階段Ⅱ：加入 2mL 組織消化液Ⅱ，37℃，搖床消化 10-15min。鏡下觀察到大部分 細胞呈細胞團塊（＜200μm）既可終止消化階段Ⅱ（注：不要消化到單細胞狀態）。 7. 終止消化階段Ⅱ：加入 8mL DPBS-PS 終止消化，300g，離心 5min，棄上清。 8. 收集細胞：加入 10mL DPBS-PS 對細胞進行重懸，使用 2mL 抗粘附液預先濕潤一個 100μm 的細胞篩網，將細胞懸液使用該細胞篩網過濾，將濾出的濾液進行離心，300g, 離心 5min，棄上清。 9. （可選步驟）如含較多紅細胞（細胞沉淀呈現紅色），加入紅細胞裂解液進行裂紅（具體 實驗方法參考產品說明書）后，300g，5min，棄上清，使用 1mL DPBS-PS 重懸。 10.計數：通過自動細胞計數儀或者手動計數板計出細胞的個數。計數后，300g,離心 5min， 棄上清，收集細胞沉淀。 11.接種：將獲取的細胞沉淀，按照 2-4*103 細胞/μL 的密度重懸于基質膠（BME 或 Matrigel）中（接種密度僅供參考，可按照實驗需求進行調整）。將基質膠重懸后的細胞 接種至 37℃預熱的細胞培養板中，注意槍尖不要接種至培養板的底部，膠滴應接種于培 養孔的中心位置，若是 24 孔板，則每孔可接種 50μL。將接種好的培養板放置在 37℃下 靜置 5min 后，倒置培養板靜置 25min。 12.補液：使用移液槍沿著孔側壁向每個孔中輕輕地加入 600μL 于 37℃預熱的腫瘤類器官完 全培養基，請勿將培養基直接加到膠滴上。將 1mL DPBS-PS 均勻加至其它未接種液滴的 孔中，以保持培養時的濕度。 13.培養：將培養板的蓋子蓋上，并在 37℃和 5％CO2 下進行培養。鏡下觀察類器官的培養 情況，適時進行換液或傳代（一般建議每 2-3 天進行全換液或半換液）。一般在接種 3-4 天后，可觀測到類器官形成。 患者來源的肺癌類器官傳代： 1. 傳代標準：在傳代前，確保大部分類器官的大小大于 100μm。 2. 消化：將培養類器官的 24 孔板取出，用移液器去除培養基，每孔加入 0.5mL TrypLE， 使用 1mL 槍頭將膠滴吹散（可根據類器官量適量增加 TrypLE 的體積）。室溫消化 5- 8min，或 37℃培養箱消化 5min（避免消化過度，影響類器官生長），顯微鏡下觀察類 器官消化情況，待大部分類器官消化至 40-60μm 大小時，即可加入 2 倍消化液體積的 DPBS-PS 終止消化。 3. 收集類器官：將消化后的類器官懸液轉入離心管中（可用抗粘附液預先潤濕離心管），保 證培養孔中的類器官都被收集起來。300g，離心 5min，去上清，收集類器官，使用 1mL DPBS-PS 重懸。 4. 計數：通過自動細胞計數板或者手動計數板計出細胞的個數。計數后，300g，離心 5min， 去上清，收集類器官。 5. 接種：將獲取的類器官沉淀，根據計數結果重懸于基質膠（Matrigel）中，一個膠滴大約 需要 200-500 個細胞團（約 2–5 萬個細胞）。吸取 50μL 細胞懸液，并加入到提前預熱 的 24 孔板（提前預熱半小時）的中心部位。（不要將類器官接種到最外側的孔中）將接 種好的培養板放置在 37℃下靜置 5min 后，倒置培養板靜置 25min，以待基質膠倒置凝 固。 6. 補液：使用移液槍沿著孔側壁向每個孔中輕輕地加入 600μL 于 37℃預熱的腫瘤類器官完 全培養基，請勿將培養基直接加到膠滴上。將 1mL DPBS-PS 均勻加至其它未接種液滴的 孔中，以保持培養時的濕度。 7. 培養：蓋上培養板板蓋，并在 37℃和 5％CO2 下進行培養。每 2-4 天進行一次全換液， 觀察生長情況，并進行拍照記錄，直至下次傳代。 注：所有接觸類器官的移液管、槍頭等類器官培養耗材均需進行潤洗，以免在傳代過程中 出現樣本的流失，推薦使用抗粘附液效果更佳。 患者來源的肺癌類器官凍存： 1. 凍存標準：觀察類器官生長情況，當類器官活性良好，大部分類器官的大小大于 100μm 時，即可進行凍存。 2. 消化：小心吸走培養孔中的培養基，每孔加入 0.5mL TrypLE，吹散膠滴，37℃培養箱， 孵育 3min，顯微鏡下觀察類器官消化情況，待類器官消化至 40-60μm 大小時，即可加 入 2 倍消化液體積的 DPBS-PS 終止消化。 3. 收集類器官：將消化后的類器官懸液轉入離心管中（可用抗粘附液預先潤濕離心管），保 證培養孔中的類器官都被收集起來。300g，離心 5min，棄上清；加入 3mL DPBS-PS 重 懸細胞，300g，離心 5min，棄上清，使用 1mL DPBS-PS 重懸。 4. 計數：通過自動細胞計數板或者手動計數板計出細胞的個數。計數后，300g，離心 5min， 去上清，收集類器官。 5. 凍存：根據類器官計數結果，加入適量類器官凍存液重懸沉淀，混合均勻后分裝至標記好 的凍存管中，類器官每管凍存細胞量約為 5*105 個，每管 1mL，若細胞量較多時應注意 分管凍存；將凍存管置于程序降溫盒中，-80℃過夜保存（或進行梯度降溫，4℃放置 20min，-20℃放置 2h，-80℃放置過夜），最后轉移至液氮罐。 |
| 注意事項 | 1. 本試劑盒僅供科研使用，使用前請仔細閱讀本說明書。 2. 本試劑盒僅適用于經細胞學或組織病理學確認的實體瘤組織標本或胸腹水的肺癌類器官培 養。 3. 本試劑盒培養結果會受到標本質量、培養條件等因素影響，同時也受到技術員操作習慣、 操作環境以及當前細胞生物學技術局限性等限制，因此可能會存在培養失敗的情況。 4. 類器官完全培養基中不含有抗生素成分，請根據實驗需求自行添加，推薦工作濃度為 1%。 5. 建議進行適當分裝，-20℃儲存，開封后，4℃保存使用，并于 2 周內用完，避免反復凍 融。 |
| 聲明 | 僅用于科研使用，不能用于臨床診斷和治療。 |
| 保存條件 | 人肺癌類器官基礎培養基:-20°C，12 個月；4°C，3個月 人肺癌類器官培養基添加物:-20°C，12 個月 組織運輸保存液:-20°C，12 個月；4℃，2 周 類器官凍存液:4°C，12 個月 組織消化液Ⅰ:-20°C，12 個月；4℃，2 周 組織消化液Ⅱ:-20°C，12 個月；4℃，2 周 Primary Enhancer:-20°C，12 個月 |
